第五章 臨床生化診斷試劑盒的選擇與評價
第一節 重點解析
一、試劑盒的分類和特點
商品試劑與標準液按檢測項目組合成一套放在一個包裝盒內叫試劑盒，或叫試劑組合。
1.液體型試劑
(1)液體單試劑 所謂液體單試劑就是將某種生化檢驗項目所用到的試劑科學地混合在一起，組成為一種試劑。應用時，只須將標本和試劑按一定比例混合，即可進行相應的生化反應，然后用適當的方法檢測結果。應用十分方便。
(2)液體雙試劑 所謂液體雙試劑就是將某些生化檢測項目所用到的試劑，按用途科學地分成兩類，分別配成兩種試劑，通常第一試劑加入后可起到全部或部分消除某些內源性干擾的作用，第二試劑為啟動被檢測物質反應的試劑，兩種試劑混合后才共同完成被檢項目的生化反應。然后用適當的方法檢測結果。
2.粉(片)劑型試劑
所謂粉劑型及片劑型試劑，即是將試劑的各組分用球磨技術粉碎成粉劑或混合后壓成片劑，使用前再加入指定的溶液復溶成液體試劑。
干粉試劑如果用固體原料研磨后制成粉劑或片劑，則存在許多問題：①要使試劑各組分混合得非常均勻，技術難度很大;②分裝過程中的稱量誤差及復溶時加水量的準確性影響試劑的瓶間差;③水質優劣對試劑的穩定性和測定的可靠性有相當大的影響。
3.其它類型試劑
(1)快速反應試劑盒 主要是加大效應酶用量縮短反應時間，提高工作效率,是一種發展趨勢。
(2)一步法試劑盒 這是利用特異性抗體參與反應的新型試劑。
(3)多項同測組合試劑盒 這類型試劑主要是用于三點雙項同測終點法、三點雙項同測連續監測法和三點雙項同測終點速率法測定的試劑盒。方法是在同一比色杯中，先后加入兩種試劑與檢品中的兩種被檢物發生反應，在各反應達到平衡期時分別測定，整個測定過程進行三次比色，測定兩個項目，稱為三點雙項同測終點法。
(4)卡式試劑盒 試劑首先裝入試劑瓶，瓶上充分使用編碼技術，而后根據編碼啟動調配、使用及更換儲存。其特點是：①卡式試劑瓶上條碼令使用者可快捷準確地輸入試劑數據，如測試數量、批號、有效期，保證正確識別試劑。②試劑裝載后能自動調配，可消除潛在誤差，并節省操作時間。③持續不斷地監察儀器上已裝載的試劑存量，并在供應量不足時通知使用者。試劑裝載使用時間可長達一個月。④所有卡式試劑盒大小劃一，有利儲存。卡式試劑設計較獨特，可防止試劑蒸發及降解，能確保試劑裝載后的穩定性更長，從而節省成本。⑤標簽根據測試類別以顏色編碼，便于使用者識別。
(5)濃縮試劑盒 上述卡式試劑盒就是采用的濃縮試劑，使用時自動完成稀釋，而后用于測定。濃縮試劑便于工作、儲存、運輸、裝載等優越性是很明顯的，濃縮試劑便于監控、減少校正次數、提高工作質量。
二、液體雙試劑盒的特點
液體雙試劑與其它類型試劑比較具有液體試劑和雙試劑的優點。
1.提高了抗干擾反應的能力 在臨床生化測定過程中，血標本除了含有待測物質外，還含有各種酶、有機物、無機鹽等物質，這些物質都會干擾或參與測試反應，引起非特異性反應干擾，而雙試劑型試劑盒設計的一個主要目的就是為了克服這種干擾反應。在測定過程中，首先讓試劑Ⅰ與標本中的干擾物質反應，反應5分鐘后，再用試劑Ⅱ啟動真正的測試反應，從而使測定結果更加準確。
2.使測定更科學合理 由于液體雙試劑的使用，使測定更加科學合理。
3.穩定性能優良 全液體酶法試劑從分配上解決了干粉、片劑型復溶后穩定性的影響：①用戶可根據每次標本量多少按一定比例配制適量工作液，當天配制當天用完，這樣便可減少試劑損失。②如果用戶使用的自動生化分析儀有雙試劑測定功能，那么，就不必把雙試劑混合成工作試劑進行測定，試劑的有效期一年便是工作液的有效期。
對于干粉、片劑型等需復溶的生化試劑，水質的好與壞直接影響了復溶后工作液的穩定性和測定重復性。如①水中F會引起某些酶失活;②水中的重金屬離子會影響酶活力;③水中某些微生物會引起酶失活，除了水中某?quot;雜質"會引起試劑中酶失活、部分失活而導致穩定性、重復性下降外，有些"雜質"會直接影響測定結查，如水中含有NH4便會直接影響尿素氮測定的準確度。
4.試劑組分高度均一 試劑中每一組分均一性是影響試劑測定重復性的一個重要因素。在干粉、片劑與凍干生化試劑生產過程要使每一試劑中十幾種組分(有的組分含量相當微量)分布相對均勻也是一個技術難度較高的課題。在每一種試劑生產過程中必須解決：①原料干粉生產過程中每一組分的均勻性(凍干生化試劑在凍干分裝前由于是液體的，每個組分是相當均勻)。②在分裝過程中由于加樣誤差引起的均勻性問題。③在使用過程中，由于需加入復溶水，復溶水的加樣誤差也會造成瓶與瓶之間同一組分濃度不盡一樣。
三、臨床生化診斷試劑的制備
1.標準品的制備
(1)標準物質應具備的條件 必備的主要條件∶ ①純度高;②定值準確可靠;③穩定性好，在保管、使用有效期內其示值誤差不超出證書的許可范圍;④均一性好，任何一份分裝的小樣品都具備整個標準物質的特性指標。附加條件∶ ①摩爾質量盡可能大;②具有符合使用目的之反應特性;③制造簡便，價格低廉，購買方便;④標準物質的組成若發生變化(如吸潮)時，可采用重新干燥(恒重)等措施使其復原。
(2)標準液的配制 標準液配制的依據∶ 供臨床生化常規測定用的標準液屬于二級標準物質，其示值的準確性對檢驗質量有重大影響，必須在標準物質選擇、恒重方法程序、基質(包括水)的質量、最優化的配方和制備工藝上都要嚴格按照我國衛生部醫政司主持編寫修訂的《全國臨床檢驗操作規程》(1997年5月，第二版)的要求進行。標準液的質量鑒定∶ 不論是實驗室自行配制或廠家生產的標準液，都需要認真地按照國家衛生部的規定做好質量檢定。提出的規范化的要求和質量檢定標準，并在標準液制備過程中應該嚴格檢定程序，使其達到質量標準。
(3)標準液的正確使用 ①應采購診斷試劑正規生產廠家生產的商品標準液，尤其有國家衛生部生產文號的產品。②一瓶標準液只能使用一次，避免反復凍融、反復使用，尤其是標準物質穩定性較差的標準液(如尿素、葡萄糖、膽紅素、白蛋白等)以及標準液的基質易揮發的標準液(如用無水乙醇配制的膽固醇標準液等)更應注意。③定值質控血清只能用于臨床生化室內質量控制及室間質量評價，不能用作常規分析的標準物質，也不能用于相應物質含量的標化或儀器分析性能準確性的評價。④按照各種標準液不同保存條件妥善保管，并在其有效期內使用。
2.試劑中常用工具酶的質量保證
工具酶是指作為診斷試劑來測定化合物濃度或酶活性的一類酶。它是酶試劑
的核心，它的質量是酶試劑質量的決定性因素。酶試劑方法已成為最有發展前途的分析方法。
臨床生化酶試劑中的工具酶主要來自動植物組織提取及微生物發酵工程。微生物發酵工程包括高產酶菌種的篩選、放大培養和酶提取純化三個部分。
為了更有效地發揮工具酶的催化效能，形成最佳的酶試劑配方，必須確切地掌握該酶對底物的專一性、分子量、等電點、Km、最適pH、最適溫度等理化特性參數，并熟悉輔助因子、激活劑和抑制劑對酶活性的影響。
工具酶的純度一般用酶的比活性和雜酶含量來表示。 酶的比活性是評價酶純度的最好標準，即每毫克(酶)蛋白所具有的酶活性(U/mg)。酶的比活性越高，酶的純度越高。為了兼顧工具酶的較低生產成本和保證酶試劑質量，對工具酶中容易引起副反應的其他酶(即所謂雜酶)含量提出了"允許限度"的要求。
3.緩沖液的配制
緩沖液是臨床生化診斷試劑的重要組成部分。緩沖液維持pH恒定的效力取決于其緩沖容量的大小。緩沖容量是指使1L溶液的pH改變個1pH單位所需要的酸或堿量(mol)。緩沖容量決定于鹽與酸(或堿)的真實濃度及兩者的比值。緩沖液的濃度越高，緩沖容量越大。一般的緩沖液總濃度在0.05～0.2mol/L之間。當總濃度固定時，鹽與酸(或堿)的比值為1時，其緩沖容量最大;如果兩者比值相差10倍以上時，則緩沖容量將大為減小。在實際工作中，不能無限制地加大緩沖液的濃度來增加其緩沖容量，因為鹽類濃度過高將抑制酶的活性，對電泳分離也有不利的影響。
配制緩沖液注意的事項為 ①所有試劑最好選用分析純或優級純，并必須恒重后方能配制。②所用儀器必須清潔，容量儀器最好經過校正，以保證準確。③配好的緩沖液必須用酸度計校正其pH值(準確至小數點后兩位)。如對其濃度有懷疑時，則應用滴定法檢查其濃度。
四、臨床生化診斷試劑盒的選擇
(一)試劑盒的性能指標
1.準確度 通常以回收率、定值血清的靶值范圍、對照試驗及干擾試驗的結果來判斷。
(1)回收試驗 回收率越接近100%，準確率越高，一般以100%±5%為合格。
(2)定值血清的測定 對于某些無法準確加入標準物的試劑盒，可用低、中、高濃度的定值血清進行測定，測得值符合定值血清的靶值范圍( ±2S)為合格。
(3)對照試驗 將被檢試劑盒與公認的參考方法同時測定若干樣本(一般要求100份，最少需30份)，計算兩組結果的相關系數和直線回歸方程。相關系數γ越接近1.0、斜率b越接近1.0，截距a越接近0，則準確度越高。相關系數要求在0.9～1.0之間，γ值符合要求不等于準確度都符合要求。b表示比例偏差，a表示恒定偏差。(1-b)×100%表示比例偏差的大小。(a值/樣品含量)×100%表示恒定偏差的大小。
(4)非特異性與干擾試驗 對維生素C、黃疸、溶血、乳糜等因素的耐受程度，干擾值越小越好。
2.精密度 試劑的瓶間差異、批內精密度和批間差異三組測定的平均值之間應無顯著差異，否則，試劑盒的均一性不符合要求。
(1)瓶間差異 同一試劑盒，取10瓶試劑復溶，測定同一樣品的含量，求平均值、標準差、變異系數。
(2)批內精密度 同一樣品用同一瓶試劑測定10次，求平均值、標準差、變異系數。
(3)批間差異 同一樣品，用不同批號的10瓶試劑測定，求平均值、標準差、變異系數。
3.線性范圍 指該試劑盒按其說明使用時可準確測量的范圍。被檢樣品的含量超出測定線性范圍，必須改變樣品與試劑體積的比例，重新測定才能得到準確結果。試劑盒的測定線性范圍是衡量試劑盒質量的一個指標，也是正確使用該試劑盒的關鍵之一。試劑盒測定線性范圍要求能覆蓋該項測定的常見醫學決定水平。
4.抗干擾作用 雙試劑型試劑盒主要優點是抗干擾作用。如ALT雙試劑盒的第一試劑能排除內源性丙酮酸干擾。此種試劑盒的第一試劑加入被檢血清后，37℃5分鐘內顯示NADH被消耗、340nm吸光度值下降的曲線，當內源性丙酮酸被消耗完，吸光度曲線平坦，加入第二試劑后，340nm吸光度立即上升，當ALT酶促反應發生后又下降。這種反應曲線顯示了ALT雙試劑具抗干擾作用。甘油三脂測定雙試劑的排除游離甘油的作用，可加入甘油標準液后進行試驗，以證實排除游離甘油的能力。
5.靈敏度 在終點法靈敏度以特定波長下1cm光徑時單位濃度的吸光度值表示，如膽固醇酶法測定試劑盒要求其靈敏度A500nm0.005時的膽固醇濃度相當于0.08mmol/L。連續監測法以特定波長下1cm光徑單位酶活性的吸光度值表示，試劑盒質量合格時，其靈敏度值與理論計算的ΔA/min×因數值一致。試劑盒的質量與靈敏度密切相關，靈敏度達不到要求的試劑盒不宜使用。
6.穩定性 試劑盒穩定性是指試劑盒在規定條件下儲存仍保持其性能指標的期限。
(1)原包裝試劑的穩定性 按說明書的保存方法儲藏，于不同時期取出一瓶復溶，測定試劑吸光度值、標準品含量、定值血清含量、線性范圍、酶促反應時間曲線或化學反應速度時間曲線及其他性能指標，直到這些指標變化超出規定值的10%以上的期限，為原包裝試劑的穩定期。
(2)復溶后試劑的穩定性 將復溶試劑分別放在4℃、25℃保存，逐日與新復溶試劑對比，觀察上述指標，直到測定結果與新復溶試劑的差值>10%以上，這一期限為復溶后試劑的穩定期。
(3)不同溫度下的保存期 將原包裝試劑盒置25℃、37℃、45℃、4℃保存，以出現說明試劑變質的指標來確定在不同溫度下的保存期。
(二)選購試劑盒的要求和注意事項
1.選購試劑盒的一般要求
(1)所采用的測定方法特異性好，靈敏度、準確度、精密度符合衛生部臨床檢驗中心、IFCC、WHO等推薦的方法性能。
(2)試劑盒的儲存期至少為1年。
(3)水溶性、低粘性、無腐蝕、無毒害、不爆炸、不易燃、不污染環境。
(4)所用標準品或標準參考物符合衛生部臨床檢驗中心、IFCC、WHO推薦的標準和要求。
2.選購試劑盒的注意事項
(1)首先要仔細閱讀試劑盒的說明書，對試劑盒選用方法有所了解，科學研究工作時應選擇參考方法試劑盒，醫療預防工作應選擇推薦的常規方法試劑盒，或選擇公認的測定方法試劑盒。此外，對試劑盒的組成、方法性能指標加以分析，是用于手工操作，還是用于自動分析儀。屬于后者，其實驗參數是否與本單位自動分析儀的實驗參數相符。
(2)有無衛生部的批準文號。凡已列入衛生部臨床檢驗體外診斷試劑審批管理范圍的試劑盒，沒有生產批準文號的，不應使用。對有生產批準文號者，也需考察生產廠家的信譽。
(3)對試劑盒的包裝、理學性能、方法學性能指標進行考察和檢測，并經實際應用。符合說明書規定及本室實驗要求者方可選購。
(4)根據本單位的日工作量、分析儀試劑用量、試劑復溶后4℃穩定期等因素綜合分析，應選購合適包裝，近期出廠的產品。
(5)注意季節對試劑質量的影響。一般在氣溫較低的季節購買試劑，防止試劑盒在運輸途中變質。
(6)在確保試劑盒質量前提下，應選購價格低的產品。
五、試劑盒的性能評價方法
1.說明書審查 審查內容包括：①試劑名稱;②用途;③測定原理和技術要求;④試劑盒內的包裝內容;⑤適用儀器;⑥標本要求;⑦測定步驟及注意事項;⑧貯存的條件及有效期;⑨性能特征，包括準確度、精確度、特異性、受干擾的程度、線性范圍、參考范圍;⑩生產單位名稱、地址、郵編及電話。
2.理學檢驗與評價 理學檢驗的內容有：①外包裝應完整牢固，封口嚴密，標簽清晰;②有詳細的用戶說明書，衛生部批準的生產文號，生產日期，有效期和保存條件;③粉劑型應均勻無凝塊，不粘附瓶壁;④液體型試劑應無沉淀，無混濁，無滲漏;⑤復溶后或液體試劑的pH應符合標準規定。
3.性能指標的檢驗與評價
(1)線性范圍的測定 試劑盒的線性范圍，既是衡量其質量的重要指標，也是保證正確使用和鑒定試劑盒的關鍵指標之一。一旦線性范圍變窄即應廢棄。造成線性范圍變窄的原因常見的有：①生產中組份投料量不足;②生產后組分穩定性差;③運輸和貯存不當等。
2.觀察時間反應曲線
(1)終點法 ①試劑空白的吸光度是否符合規定標準，否則會影響測定的精密度和準確度;②試劑空白的時間反應曲線應平坦，且無明顯波動，否則，說明試劑本身不穩定，會導致測定偏差;③反應能否在規定的時間內達到平衡，達到平衡的時間應在終點法讀取測定吸光度的時間之前。反應速度慢的原因，常為試劑中酶量不足或酶質量不好，或反應條件不是最適條件;④反應達到平衡后，吸光度最大并維持不變，這一期間為反應平衡期，終點法測定應在這一期間讀取吸光度。
(2)連續監測法 ①試劑空白值是否符合規定，吸光度下降型的反應，試劑空白吸光度應在1.5左右，吸光度上升型的試劑空白吸光度越低越好，不符合說明書中規定值者不宜使用;②試劑空白的時間反應曲線應平坦，吸光度變化(△A/min)應≤0.001，若大于此值，表明試劑本身分解變化，會使測定結果產生誤差;③延遲期、線性反應期與設定的實驗參數是否相符，若不相符應予修改;④觀察時間反應曲線的斜率，通過定值血清，分析試劑盒的靈敏度。當試劑盒中底物濃度不足，輔助酶或指示酶的酶量不足或質量不好，反應條件不是最適條件等情況時，時間反應曲線斜率下降，靈敏度低，測定結果有嚴重比例誤差，這種試劑盒無法糾正，不能使用。
3.穩定性試驗 評估試劑盒的穩定性應包括原包裝和工作液在試劑盒指定條件下的穩定性。試劑盒的穩定性與貯存條件密切相關，工作液的穩定性還和使用中污染與否有關，在評估時，須保持指定貯存條件并要嚴防污染。
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